تهیه و کلون ژن های القاکننده پرتوانی از مرحله جنینی موش و انتقال آن ها به وکتور پستانداری

چکیده رویکرد جدید محققین پس از مواجهه با مشکلات استفاده از سلول های بنیادی جنینی و بالغ در درمان، القای پرتوانی در سلول های سوماتیک است که با انتقال چهار فاکتور oct3/4، sox2، klf4 و c-myc انجام می گیرد. هدف از انجام این پروژه، تهیه و کلون نواحی رمزکننده این ژن ها از سلول های مرحله جنینی موش و انتقال آنها به ناقل های پستانداری برای انجام تحقیقات در خصوص تولید سلول های بنیادی القایی و زمینه های مشابه بود. عدم امکان دسترسی به این سازه ها و از طرف دیگر نیاز به راه اندازی و انجام یک سری تکنیک های سلولی و مولکولی در گروه، ما را بر آن داشت تا با پی ریزی تدریجی (علمی و تکنیکی) و تهیه این فاکتورها به طور بومی در زمینه ورود به بحث پرتوانی گام برداریم. برای انجام این کار، پس از جدا کردن جنین های موش در مرحله بلاستوسیست و مرحله 5/12 روزگی و همچنین کشت سلول های بنیادی جنینی، محتوای rna آن ها جدا شده و با روش rt-pcr ، منبع cdna از آن ها تهیه شد. سپس با پرایمرهای اختصاصی و بهینه کردن شرایط، cdna چهار فاکتور تهیه و در ناقل مناسب با ترانسفورماسیون باکتری، همسانه سازی شد. سپس جهت اطمینان از صحت توالی تعیین سکانس شده و پس از آن cdna هر فاکتور از ناقل تکثیری جدا شده و در ناقل بیانی مناسب پستانداری همسانه سازی گردید. پس از انجام اهداف این پروژه و ثبت پلی مورفیسم جدیدی از klf4 در پایگاه ncbi، بیان پروتئینی این فاکتورها نیز پس از ایجاد سازه ژنتیکی همراه با egfp برای klf4، با لیپوفکشن سلول های nih3t3 با این فاکتورها به طور جداگانه و انجام تکنیک های rt-pcr و ایمنوسیتوشیمی اثبات گردید. دیگر فاکتور پرتوانی به نام نانوگ نیز با روش های راه اندازی شده همسانه سازی شد.